复方丹参滴丸对人血管内皮细胞的保护作用

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摘 要



     目的 观察复方丹参滴丸(DSP)对细菌内毒素(LPS)所致人血管内皮细胞(VEC)功能及形态结构损伤的作用。方法 体外培养人脐静脉内皮细胞,建立脂多糖损伤模型,在VEC损伤前及损伤后按分组分别加入不同浓度DSP(1 g/L、0.5 g/L、0.25 g/L、0.1 g/L),测定细胞活力、一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)、内皮素1(ET-1)、细胞内钙浓度,观察细胞形态。结果 损伤后给予不同浓度DSP,LPS所致VEC损伤均明显减轻 (P<0.05)。其中0.5 g/L作用最为突出(P<0.01)。损伤前给药,0.5 g/L和0.25 g/L DSP对VEC损伤有明显保护作用 (P<0.05),而1 g/L和0.1 g/L DSP组VEC损伤虽有减轻,但无统计学意义(P>0.05)。在损伤前、后分别给予不同浓度DSP,VEC形态结构损伤明显减轻。结论 DSP对VEC的功能和形态具明显保护作用。



   



    研究背景



     以动脉粥样硬化(AS)为基础的心脑血管疾病是目前发病率和病死率最高的疾病。在AS形成过程中,VEC病变起重要作用。许多因素可致VEC受损,主要包括内毒素、炎症介质和自由基。大量研究表明,内毒素参与AS的形成过程。



     近年来,内皮功能障碍与心血管疾病的关系受到极大关注。加强对内皮功能障碍的逆转性治疗是心血管疾病治疗领域一个新的发展趋势。



     DSP是中医传统理论和现代科学技术相结合研制成的一种以丹参(丹参素)为主的复合制剂,含有丹参、三七、冰片等活血化瘀、理气止痛药物。该剂型用固体分散方法制成,药物溶出速度快,生物利用度高,且稳定性好。作为复方中成药已被广泛用于心脑血管病的治疗,并取得良好疗效。本实验通过评估DSP对LPS所致VEC损伤的影响,探讨DSP在心脑血管疾病防治中的作用机制。



    研究设计



     实验分组如下:① 正常对照组:培养正常VEC;② 损伤组<img src="images/smilies/sweat.gif" smilieid="10" border="0" alt="" />PS 10 mg/L培养液培养VEC 12h;③ 防护组:用浓度分别为1 g/L、0.5 g/L、0.25 g/L或0.1 g/L的DSP培养液培养VEC 12h,再加入10 mg/L LPS培养液培养12h;④ 治疗组:10 mg/L LPS培养液培养VEC 12h,再加入各浓度DSP培养液培养12h。



     观察指标包括:测定细胞活力、NO、NOS、ET-1及细胞内钙浓度,在倒置显微镜、倒置相差显微镜、激光共聚焦显微镜、透射电镜下观察细胞形态。



    研究结果



     1. 细胞活力



     LPS作用于VEC 12h后细胞活力明显下降,给予不同浓度DSP后MTT吸光度值明显升高(组内P&lt;0.05,组间P&lt;0.01)。在损伤前给予DSP,只有0.5 g/L和0.25 g/L组MTT值有显著差异(P&lt;0.05),1 g/L及0.1 g/L组差异无统计学意义(P&gt;0.05)。



     2. 细胞上清液内NO和NOS水平



     LPS作用于VEC 12h后NO及NOS分泌量明显升高(P&lt;0.05),给予不同浓度DSP后NO及NOS明显降低。在损伤前给予DSP,只有0.5 g/L和0.25 g/L组有显著差异(P&lt;0.05)。



   



     3. 细胞上清液内ET-1水平



     LPS作用于VEC 12h后,ET-1水平明显降低(P&lt;0.05),给予不同浓度DSP后,ET-1水平明显升高。在损伤前给予DSP,只有0.5 g/L和0.25 g/L组有显著差异(P&lt;0.05),另两组无统计学意义。



   



     4. 细胞内钙浓度



     LPS可明显引起细胞内钙浓度升高,细胞内钙荧光强度明显加强。损伤前、后给予DSP均可使钙荧光强度有不同程度的下降。



   



     5. 细胞形态



     倒置显微镜下,正常组细胞生长状态好,细胞呈梭形或圆形,紧密贴壁,呈铺路石状生长,细胞折光性好,分裂相多。LPS损伤组细胞形态明显不规则,细胞缩小变圆,局部细胞融合,坏死细胞崩解,坏死细胞较多。



     透射显微镜下,正常组细胞为不规则形或椭圆形,细胞表面有许多微绒毛结构,细胞核偏于细胞一端,核膜下异染色质边集,常染色质位于中心,细胞器数量较少(图1G)。LPS损伤后,细胞坏死数量明显增多。细胞形态明显不规则,质膜表面伸出长长的突起,微绒毛消失(图1H)。损伤后给予DSP,细胞损伤减轻,大部分线粒体结构完好,核周溶酶体较多,质膜下可见脂滴堆积(图 1I)。损伤前给予DSP,细胞表面伸出长长的质膜叶片,正在脱失。细胞内细胞器结构完好,线粒体嵴清晰可见,脂滴堆积(图1J)



     激光共聚焦显微镜下,正常组细胞形态规则,荧光染色清晰,细胞状态好(图1A)。LPS损伤组细胞形态不规则,荧光强度明显增强,坏死崩解细胞明显增多,细胞状态差(图1B)。治疗组除0.1 g/L DSP组外,细胞损伤均明显减轻,坏死细胞数量明显减少,荧光强度降低(图1C、D)。0.1 g/L DSP组仍见大量不规则细胞,细胞表面突起增加,坏死细胞较多,钙荧光强度明显增强(图1E、F)



    讨论



     VEC是内毒素及各种细胞因子作用的主要靶细胞。LPS可通过直接或间接的方式激活并损伤VEC,引起形态和功能的改变。



     NO可由VEC分泌,是舒张血管的主要因子之一。炎性或免疫刺激下大量NO产生,与超氧阴离子等自由基反应,生成毒性更大的过氧亚硝基阴离子,这是NO毒性作用的主要机制。



     ET是由VEC产生的一种作用持久且强烈的缩血管因子,通过磷酸肌醇途径收缩血管。



     正常情况下,ET和NO处于动态平衡状态,维持血管舒缩功能。平衡被破坏时血管收缩,出现高血压、动脉粥样硬化等一系列心血管疾病。



     研究显示,经LPS处理后,细胞活性明显下降,细胞上清液内NO及NOS含量急剧增加,ET含量明显下降,ET和NO的平衡状态遭到破坏,VEC功能受损,形态学上出现细胞坏死数量明显增多,细胞表面绒毛消失,无绒毛结构,细胞器数量相对减少,高尔基运输泡增大,扁平囊崩解,粗面内质网膜脱颗粒、线粒体嵴断裂,基质密度增大,线粒体嵴致密粗大等细胞氧化功能明显受损的征象。在给予不同浓度DSP后,NO含量下降,ET水平增高,ET和NO比例改变,细胞活性明显恢复,形态学上出现坏死细胞明显减少,细胞损伤明显减轻。细胞表面有很多绒毛,大部分线粒体结构完好,线粒体轻微空泡变,高尔基运输泡消失。核结构恢复好,但膜结构恢复不是很完好,与正常细胞相比,胞质内脂滴明显增多(细胞受损的表现)。而在LPS损伤前给予0.5 g/L和0.25 g/L DSP防护时,也会出现坏死细胞明显减少,细胞损伤明显减轻,但DSP 0.1 g/L和 l g/L组细胞损伤减轻不明显。



     激光共聚焦显微镜下,LPS损伤组钙荧光强度明显增强,细胞内钙含量增加。在损伤前、后给予DSP,各组钙荧光强度均有不同程度下降,即细胞内钙减少。VEC的许多功能与细胞内游离钙浓度有关。VEC内游离钙浓度突然大量升高或达到一定程度,都可导致VEC损伤甚至死亡。



     本研究表明,LPS能引起VEC内游离钙浓度升高,说明LPS损伤VEC的机制可能是以钙离子为信使进行细胞间信号传递。由此推断,DSP对VEC的保护可能是通过抑制钙内流而实现。(参考文献从略) <img width="200" height="177" src="http://www.cmt.com.cn/article/080327/c110102.jpg" border="0" alt="" /> 图1 各种显微镜下观察到的细胞形态     A:正常对照组; B<img src="images/smilies/sweat.gif" smilieid="10" border="0" alt="" />PS损伤组; C<img src="images/smilies/sweat.gif" smilieid="10" border="0" alt="" />PS 0.5 g/L DSP组; D<img src="images/smilies/sweat.gif" smilieid="10" border="0" alt="" />PS 0.25 g/L DSP组;E<img src="images/smilies/biggrin.gif" smilieid="3" border="0" alt="" />SP 1 g/L LPS组; F<img src="images/smilies/biggrin.gif" smilieid="3" border="0" alt="" />SP 0.1 g/L LPS; G:正常对照组(×2000); H<img src="images/smilies/sweat.gif" smilieid="10" border="0" alt="" />PS损伤组(×2000); I<img src="images/smilies/sweat.gif" smilieid="10" border="0" alt="" />PS  0.5 g/L DSP组(×8000); J:0.5 g/L DSP LPS组(×8000)




     目的 观察复方丹参滴丸(DSP)对细菌内毒素(LPS)所致人血管内皮细胞(VEC)功能及形态结构损伤的作用。方法 体外培养人脐静脉内皮细胞,建立脂多糖损伤模型,在VEC损伤前及损伤后按分组分别加入不同浓度DSP(1 g/L、0.5 g/L、0.25 g/L、0.1 g/L),测定细胞活力、一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)、内皮素1(ET-1)、细胞内钙浓度,观察细胞形态。结果 损伤后给予不同浓度DSP,LPS所致VEC损伤均明显减轻 (P&lt;0.05)。其中0.5 g/L作用最为突出(P&lt;0.01)。损伤前给药,0.5 g/L和0.25 g/L DSP对VEC损伤有明显保护作用 (P&lt;0.05),而1 g/L和0.1 g/L DSP组VEC损伤虽有减轻,但无统计学意义(P&gt;0.05)。在损伤前、后分别给予不同浓度DSP,VEC形态结构损伤明显减轻。结论 DSP对VEC的功能和形态具明显保护作用。



   



    研究背景



     以动脉粥样硬化(AS)为基础的心脑血管疾病是目前发病率和病死率最高的疾病。在AS形成过程中,VEC病变起重要作用。许多因素可致VEC受损,主要包括内毒素、炎症介质和自由基。大量研究表明,内毒素参与AS的形成过程。



     近年来,内皮功能障碍与心血管疾病的关系受到极大关注。加强对内皮功能障碍的逆转性治疗是心血管疾病治疗领域一个新的发展趋势。



     DSP是中医传统理论和现代科学技术相结合研制成的一种以丹参(丹参素)为主的复合制剂,含有丹参、三七、冰片等活血化瘀、理气止痛药物。该剂型用固体分散方法制成,药物溶出速度快,生物利用度高,且稳定性好。作为复方中成药已被广泛用于心脑血管病的治疗,并取得良好疗效。本实验通过评估DSP对LPS所致VEC损伤的影响,探讨DSP在心脑血管疾病防治中的作用机制。



    研究设计



     实验分组如下:① 正常对照组:培养正常VEC;② 损伤组<img src="images/smilies/sweat.gif" smilieid="10" border="0" alt="" />PS 10 mg/L培养液培养VEC 12h;③ 防护组:用浓度分别为1 g/L、0.5 g/L、0.25 g/L或0.1 g/L的DSP培养液培养VEC 12h,再加入10 mg/L LPS培养液培养12h;④ 治疗组:10 mg/L LPS培养液培养VEC 12h,再加入各浓度DSP培养液培养12h。



     观察指标包括:测定细胞活力、NO、NOS、ET-1及细胞内钙浓度,在倒置显微镜、倒置相差显微镜、激光共聚焦显微镜、透射电镜下观察细胞形态。



    研究结果



     1. 细胞活力



     LPS作用于VEC 12h后细胞活力明显下降,给予不同浓度DSP后MTT吸光度值明显升高(组内P&lt;0.05,组间P&lt;0.01)。在损伤前给予DSP,只有0.5 g/L和0.25 g/L组MTT值有显著差异(P&lt;0.05),1 g/L及0.1 g/L组差异无统计学意义(P&gt;0.05)。



     2. 细胞上清液内NO和NOS水平



     LPS作用于VEC 12h后NO及NOS分泌量明显升高(P&lt;0.05),给予不同浓度DSP后NO及NOS明显降低。在损伤前给予DSP,只有0.5 g/L和0.25 g/L组有显著差异(P&lt;0.05)。



   



     3. 细胞上清液内ET-1水平



     LPS作用于VEC 12h后,ET-1水平明显降低(P&lt;0.05),给予不同浓度DSP后,ET-1水平明显升高。在损伤前给予DSP,只有0.5 g/L和0.25 g/L组有显著差异(P&lt;0.05),另两组无统计学意义。



   



     4. 细胞内钙浓度



     LPS可明显引起细胞内钙浓度升高,细胞内钙荧光强度明显加强。损伤前、后给予DSP均可使钙荧光强度有不同程度的下降。



   



     5. 细胞形态



     倒置显微镜下,正常组细胞生长状态好,细胞呈梭形或圆形,紧密贴壁,呈铺路石状生长,细胞折光性好,分裂相多。LPS损伤组细胞形态明显不规则,细胞缩小变圆,局部细胞融合,坏死细胞崩解,坏死细胞较多。



     透射显微镜下,正常组细胞为不规则形或椭圆形,细胞表面有许多微绒毛结构,细胞核偏于细胞一端,核膜下异染色质边集,常染色质位于中心,细胞器数量较少(图1G)。LPS损伤后,细胞坏死数量明显增多。细胞形态明显不规则,质膜表面伸出长长的突起,微绒毛消失(图1H)。损伤后给予DSP,细胞损伤减轻,大部分线粒体结构完好,核周溶酶体较多,质膜下可见脂滴堆积(图 1I)。损伤前给予DSP,细胞表面伸出长长的质膜叶片,正在脱失。细胞内细胞器结构完好,线粒体嵴清晰可见,脂滴堆积(图1J)



     激光共聚焦显微镜下,正常组细胞形态规则,荧光染色清晰,细胞状态好(图1A)。LPS损伤组细胞形态不规则,荧光强度明显增强,坏死崩解细胞明显增多,细胞状态差(图1B)。治疗组除0.1 g/L DSP组外,细胞损伤均明显减轻,坏死细胞数量明显减少,荧光强度降低(图1C、D)。0.1 g/L DSP组仍见大量不规则细胞,细胞表面突起增加,坏死细胞较多,钙荧光强度明显增强(图1E、F)



    讨论



     VEC是内毒素及各种细胞因子作用的主要靶细胞。LPS可通过直接或间接的方式激活并损伤VEC,引起形态和功能的改变。



     NO可由VEC分泌,是舒张血管的主要因子之一。炎性或免疫刺激下大量NO产生,与超氧阴离子等自由基反应,生成毒性更大的过氧亚硝基阴离子,这是NO毒性作用的主要机制。



     ET是由VEC产生的一种作用持久且强烈的缩血管因子,通过磷酸肌醇途径收缩血管。



     正常情况下,ET和NO处于动态平衡状态,维持血管舒缩功能。平衡被破坏时血管收缩,出现高血压、动脉粥样硬化等一系列心血管疾病。



     研究显示,经LPS处理后,细胞活性明显下降,细胞上清液内NO及NOS含量急剧增加,ET含量明显下降,ET和NO的平衡状态遭到破坏,VEC功能受损,形态学上出现细胞坏死数量明显增多,细胞表面绒毛消失,无绒毛结构,细胞器数量相对减少,高尔基运输泡增大,扁平囊崩解,粗面内质网膜脱颗粒、线粒体嵴断裂,基质密度增大,线粒体嵴致密粗大等细胞氧化功能明显受损的征象。在给予不同浓度DSP后,NO含量下降,ET水平增高,ET和NO比例改变,细胞活性明显恢复,形态学上出现坏死细胞明显减少,细胞损伤明显减轻。细胞表面有很多绒毛,大部分线粒体结构完好,线粒体轻微空泡变,高尔基运输泡消失。核结构恢复好,但膜结构恢复不是很完好,与正常细胞相比,胞质内脂滴明显增多(细胞受损的表现)。而在LPS损伤前给予0.5 g/L和0.25 g/L DSP防护时,也会出现坏死细胞明显减少,细胞损伤明显减轻,但DSP 0.1 g/L和 l g/L组细胞损伤减轻不明显。



     激光共聚焦显微镜下,LPS损伤组钙荧光强度明显增强,细胞内钙含量增加。在损伤前、后给予DSP,各组钙荧光强度均有不同程度下降,即细胞内钙减少。VEC的许多功能与细胞内游离钙浓度有关。VEC内游离钙浓度突然大量升高或达到一定程度,都可导致VEC损伤甚至死亡。



     本研究表明,LPS能引起VEC内游离钙浓度升高,说明LPS损伤VEC的机制可能是以钙离子为信使进行细胞间信号传递。由此推断,DSP对VEC的保护可能是通过抑制钙内流而实现。(参考文献从略) <img width="200" height="177" src="http://www.cmt.com.cn/article/080327/c110102.jpg" border="0" alt="" /> 图1 各种显微镜下观察到的细胞形态     A:正常对照组; B<img src="images/smilies/sweat.gif" smilieid="10" border="0" alt="" />PS损伤组; C<img src="images/smilies/sweat.gif" smilieid="10" border="0" alt="" />PS 0.5 g/L DSP组; D<img src="images/smilies/sweat.gif" smilieid="10" border="0" alt="" />PS 0.25 g/L DSP组;E<img src="images/smilies/biggrin.gif" smilieid="3" border="0" alt="" />SP 1 g/L LPS组; F<img src="images/smilies/biggrin.gif" smilieid="3" border="0" alt="" />SP 0.1 g/L LPS; G:正常对照组(×2000); H<img src="images/smilies/sweat.gif" smilieid="10" border="0" alt="" />PS损伤组(×2000); I<img src="images/smilies/sweat.gif" smilieid="10" border="0" alt="" />PS  0.5 g/L DSP组(×8000); J:0.5 g/L DSP LPS组(×8000)